檢測(cè)說(shuō)明

環(huán)二鳥(niǎo)苷單磷酸 (c-di-GMP) 檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單的混合讀取、高選擇性、HTS 就緒檢測(cè)，用于測(cè)量細(xì)胞中的 c-di-GMP 水平。這種均相測(cè)定可用于檢測(cè)任何產(chǎn)生 c-di-GMP 的生化或酶促反應(yīng)中的 c-di-GMP，或用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi) c-di-GMP 濃度的細(xì)胞應(yīng)用。

測(cè)定原理

熒光信號(hào)的演變?nèi)Q于 c-di-GMP 與傳感器中 c-di-GMP 核糖開(kāi)關(guān)的初始結(jié)合。這導(dǎo)致菠菜TM適體的穩(wěn)定，進(jìn)而結(jié)合 DFHBI-1T 以產(chǎn)生熒光。可以使用 GFP/FITC 濾光片組或 482nm 激發(fā)和 505nm 發(fā)射來(lái)測(cè)量熒光。

便于使用

c-di-GMP 檢測(cè)易于使用且均質(zhì)。只需將您的樣品與提供的檢測(cè)試劑一起孵育 30 分鐘，然后在帶有 FITC/GFP 濾光片或激發(fā)波長(zhǎng) 482nm 和發(fā)射波長(zhǎng) 505nm 的熒光讀板機(jī)上讀取樣品。

快速響應(yīng)和良好的信號(hào)穩(wěn)定性

c-di-GMP 傳感器在檢測(cè) c-di-GMP 時(shí)會(huì)迅速產(chǎn)生信號(hào)，因此可以進(jìn)行快速測(cè)量。熒光信號(hào)隨著時(shí)間的推移是穩(wěn)定的，因此允許樣品的批處理模式。早在測(cè)定設(shè)置的 30 分鐘即可獲得出色的 HTS 參數(shù)，并在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)保持高水平。

寬動(dòng)態(tài)范圍

該檢測(cè)即使在 50nM 的 c-di-GMP 下也很靈敏，并且具有寬廣的動(dòng)態(tài)范圍。

選擇性

c-di-GMP 傳感器對(duì) c-di-GMP 具有高度選擇性，不受常見(jiàn)反配體的干擾。

即使與過(guò)量 500 – 1,000 倍的反配體（例如 GMP、pGpG 和 c-AMP-GMP）相比，該測(cè)定也實(shí)現(xiàn)了出色的 HTS 測(cè)定參數(shù)（Z 因子 >0.9）。

與基于細(xì)胞的檢測(cè)的兼容性

c-di-GMP 測(cè)定可用于以均質(zhì)形式測(cè)量細(xì)菌中的細(xì)胞內(nèi) c-di-GMP 濃度，無(wú)需造粒、裂解或洗滌步驟。只需用 BC 試劑補(bǔ)充含有細(xì)菌培養(yǎng)物的測(cè)定緩沖液，添加傳感器和熒光團(tuán)，孵育 30 分鐘，然后在熒光閱讀器上讀取。

細(xì)菌中的 c-di-GMP 估計(jì)

表達(dá)野生型 WspR（來(lái)自銅綠 假單胞菌的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶）的大腸桿菌細(xì)胞用呋喃西林（抗生素）、二甲基甲酰胺/DMF（載體）處理或不處理（對(duì)照）。此外，還以不同的細(xì)胞密度接種細(xì)菌以模擬不同的 c-di-GMP 水平。在 96 孔板中生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中的 Cyclic-di-GMP 濃度在沒(méi)有任何沉淀、洗滌、裂解或有機(jī)提取的情況下進(jìn)行測(cè)量。

c-di-GMP 標(biāo)準(zhǔn)曲線

抗生素或載體的存在不影響 c-di-GMP 測(cè)定的性能。

WT WspR 細(xì)胞中的 c-di-GMP 估計(jì)

c-di-GMP 測(cè)定顯示細(xì)菌中 c-di-GMP 濃度的變化，以響應(yīng)抗生素處理和不同細(xì)菌細(xì)胞密度。

該產(chǎn)品被引用于：

凝聚素通過(guò)控制表型程序對(duì)銅綠假單胞菌角膜毒力至關(guān)重要。趙和等。生物Rxiv。2021。